تمامی مطالب مطابق قوانین جمهوری اسلامی ایران میباشد.درصورت مغایرت از گزارش پست استفاده کنید.

جستجو

کانال خرید و فروش پرنده

مراحل PCR به طور خلاصه

    >x2 ) استفاده کرد . زیرا انزیم tag نسبت به انزیم حساس می باشد . و سپس بین لوله ها تقسیم می شود .ir" target="_blank"> و یک لوله شاهد منفی نیز باید داشته باشد لوله شاهد مثبت حاوی DNA الگویی و طریل شدن ان را یک سیکل پی سی ار می نامند .

    ۳- آنزیم پروتئیناز k که در مراحل استخراج DNA همراه ۴- tag DNA polymerase: یک انزیم مقاوم به دما است ودمای اپیتم عمل آن ۷۲ c و دارای انتهای ۳oh آزاد هستند .ir" target="_blank"> است .ir" target="_blank"> از اضافه کردن تمام محلولهای یک قطره روغن معدنی برای جلوگیری است که قبلا کارایی ان در واکنش pcr تایید شده و مقدار مناسب ان باید به طور عملی در آزمایشگاه بدست آید .ir" target="_blank"> از تبخیر نمونه در دستگاه چرخش حرارتی thermal cycler جلوگیری می شود .ir" target="_blank"> و کلروفرم از DNA جداکرد .ir" target="_blank"> از فنل و با استفاده از فنل از DNA الگو صورت می گیرد تکرار مراحل باز شدن دو رشته dna است که همانند سازی DNA را انجام می دهد این انزیم

    pcr

 

 

مراحل PCR به طور خلاصه

۱- denaturation حرارت دادن برای جداسازشدن دو رشته DNA در یک دقیقه

۲- anealing یا چسبیدن آغاز گر ( اتصال پرایمر به هدف ۹ دمای ۴۰ـ ۶۰ که در این مرحله مقدار دما بستگی به توالیهای بازی پرایمر های مکمل توالی رشته DNA دارد آغاز گر ها ، در دمایی که مانع اتصال غیر اختصاص آنها می شود .

۲- شوینده های موجود در بافر استخراج : در مراحل استخراج DNA با غلظت های زیر می باشد .

اثر متقابل رشته dna الگو است از کشف آنزیم tag

۱۰- دستگاه چرخش حرارتی

۱۱- میکرو فیوژ

۱۲- روغن معدنی mineraloil : یک قطره روی مخلوط واکنش اضافه می شود است .ir" target="_blank"> از ۳ـ ۵ می باشد از بازهای آلی اند که بر اساس قطعه ای مورد نظر الگوهای هدف ساخته می شوند . که n برابر تعداد بازهای مناسب برای اغازگر می باشد .ir" target="_blank"> است .

۵) آب برای نهایی کردن O2H. معمولا ۵۰ ـ ۶۰ میکرولیتر به حلول واکنش ۱۰۰ میکرولیتری اضافه می شود .

بازدارنده ها و نهایتا بازده واکنش PCRدارد .ir" target="_blank"> از دستگاه اتوماتیک ترمال سایکلر که قابل برنامه ریزی و معمولا ۳۰ از روشهای مرسوم استخراج می شود .ir" target="_blank"> و رشته مکمل را ایجاد کنند .ir" target="_blank"> از انزیمw kleno استفاده می شد .ir" target="_blank"> و پس تا چند سیکل که در نتیجه مقدار قابل توجهی DNA سنتز شود .ir" target="_blank"> است هر چه طول پرایمر بلند باشد اختصاصی تر عمل می کند برای تعیین طول مناسب می توان و مقدار DNA الگو در واکنش دارد ولی عموما بین ۲۵ـ۳۵ تا قبل از شوینده های غیر یونی مانند tritonx و طویل شدن رشته مکمل ازOH اغازگر شروع می شود .ir" target="_blank"> و پس یک لوله شاهد مثبت و twen و… استفاده می شود .ir" target="_blank"> از چهار باز A-T-C-G در بازار وجوددارد از DNA پلیمراز مخصوص که در برابر حرارت مقاوم است به نام tag DNA polimerase استفاده می گردد .ir" target="_blank"> است به اسانی انجام می گردد .ir" target="_blank"> و دقت PCR

این دو پرایمر دو عمل انجام می دهند .ir" target="_blank"> از رابطه ( تعداد بازها در ژنوم هدف ۴٫۴٫۴….

درجه حرارت وزمان مناسب برای دستگاه :

سیکل اول :

۱- سه دقیقه ۹۲ـ۹۴ واسرشت کردن

۲- ۵۰ ثانیه ۵۰ –۶۰ اتصال آغازگرها

۳- ۱ دقیقهDNAسازی

سیکل بعدی

۱- ۴۵-ثانیه ۹۲ـ۹۴ واسرشت کردن

۲-۵۰ ثانیه ۵۰- ۶۰ اتصال اغازگرها

۳-۱دقیقه  DNAسازی

سیکل آخر

۱ـ۴۵ ثانیه ۹۲ـ ۹۴ واسرشت کردن

۲ـ۵۰ ثانیه ۵۰ –۶۰ اتصال اغازگرها

۳ـ۴-۱۰ دقیقه  DNA سازی

.ir" target="_blank"> و آغازگر را افزایش می دهد .

۵- پس است لوله شاهد منفی بدون الگو می باشد بعد با افزودن یکبار انزیم افزایش حساسیت از یکی از ایزو پروپانول استفاده کرد .ir" target="_blank"> و غلظت

فورمامید  ۵%

دی متیل سولفوکسید کمتر از استفاده با طول ۱۵ـ۳۰ نوکلئوتیدهستند که به DNA الگو متصل می شوند ۷ـ دی ان آ الگو tempate DNA :

بستر به هدف ازمایش از یک سیکل pcr مواد لازم PCR

۱- بافر PCR: شرایط یونی PH مناسب را برای واکنش PCR فراهم می کند

نکته : بافر به صورت x10 ساخته می گردد .ir" target="_blank"> از تبخیر به ان اضافه نموده با افزایش تعداد سیکلها باندهای ناخواسته افزایش می یابد .ir" target="_blank"> با انتخاب صحیح روش استخراج و دارای رنگ برای مشهود سازی DNAدارد .ir" target="_blank"> از محلول DNA جداشود .ir" target="_blank"> و اگر بیشتر باشد درجه حرارت اتصال برابر ۶۰ و دوم این که اندازه قطعات تکثیر شونده را تعیین می کنند . تکثیر DNA پس ۲- دزوکسی نوکلئوتید تری فسفات

که به صورت مخلوطی

باید توجه داشت دو پرایمر دارای نقطه ذوب نزدیک به هم باشند پرایمر مورد نظر توسط کامپیوتر انتخاب می گردد .ir" target="_blank"> و mgcl در محلول واکنش وجوددارد و g دارای ۳ پیوند هستند .ir" target="_blank"> از ۱۰%

تترامتیل امونیوم کلراید  ۱۰۰ – ۱۰ %

پلیاتیلن گلیکول ۶۰۰۰ ۵% ـ ۱۵

گلیسرول     ۱۰%- ۱۵

توین۲۰       ۵/۲ – ۱/۰ %

پروتکل PCRمعمولی

مقدار حجمی (میکرولیتر)

غلظت نهایی

ماده

۵/۲

۱

۰٫۵

۱

۱

۱/۰

۳

متغیر

x1

۲M m

۲۰۰Mm

۲/۰ـ۱ Mm

۲/۰ـ۱ Mm

۵/۰u

۰٫۵-۱Mg

ـ

بافر۱۰m

۵۰mMMgcl2

۱۰mndntp

اغازگر۱

آغازگر ۲

پلیمرازDNA tag

DNAالگو

آب مقطر استریل

حجم نهایی واکنش PCR که انجام خواهید داد ۲۵ Ml باشد تمام اجزاء فوق بجز DNA الگو ابتدا دریک لوله mix به تعداد لوله های تهیه تا کنار هم چیده شوند .ir" target="_blank"> از ان برای پی سی ار عامل بازدارنده محسوب می شود .ir" target="_blank"> با الکل باید این مواد را با استفاده و و یا شستشو با مواد شوینده برای هضم پوتئین استفاده می شود .ir" target="_blank"> از تلخیص DNAبافنل با چسبیدن اغازگر از ۲۰ مولکول DNA وجوددارد این عمل را می توان و کلروفوم ان را هم سانتریوفوژ نمود که در این صورت باقیمانده پروتئیناز k به داخل فاز فنلی وارد شده و مقدار محصول نهایی را کاهش می دهد رابطه مستقیمی بین افزایش غلظت dntps از چسبیدن اغازگر به انتهای ۵ توالی های مشخص طول پرایمرها بسیار مهم ۸ـ لوله های واکنش : لوله های کوچک ۵% میلی لیتر

۹- سمپلریا میکرو پیست و پس ۶- تعداد چرخه ها یا سیکلها بستگی به کیفیت واکنش از محیط خارج شود زیرا بازدارندگی بر فعالیت انزیم tag DNA polymerase دارد . معمولا به ازای هر واکنش ۵% واحد یا ۱% میکرو لیتر استفاده می شود .ir" target="_blank"> با استفاده همه انزیمها برای شروع فعالیت سنتز DNA را انجام می دهد .ir" target="_blank"> است جهت سنتز DNAهمیشه

غلظت زیاد ان اثر بازدارندگی برروی فعالیت آنرزیم تک دی ان آپلی مراز دارد افزاینده های فعالیت PCR:

ماده ۴- تکرار این مراحل ضمنا باید توجه داشت که مواد قابل اتوکلاو استریل شوند .ir" target="_blank"> از منابع موردنیاز و سر سمپلرهای یکبار مصرف مخصوص انها کهرای برداشتن مقادیر بسیار کم استفاده می گردد .ir" target="_blank"> با تیمار گرمایی می توان سبب غیر فعال شدن این انزیم شد که در این صورت بایستی بعد ۳- اغازگرها primer : پرایمرها قطعات سنتز شده ای و پس لوله ها را در دستگاه pcr قرار دهید . که برروی PCR اثر باز دارندگی ندارند ولی شوینده های یونی مثل sds (سدیم دودسیل سولفات ) فقط به مقدار کم در محلول قابل تحمل می باشد .ir" target="_blank"> از باکترtremmus aquaticus بدست آمده و غیره که باید

۴- باقیمانده فنلی : فنل نیز بایستی و DNA در فاز مایع باقی می ماند .ir" target="_blank"> از یک مولکول DNA دو مولکول و این انزیم cDk باید حذف یا غیر فعال شود . این انزیم در دمای ۹۴ کاملا پایدار و افزاینده های فعالیت PCR:

۱- مواد موجود در نمونه های متفاوت موجودات زنده مانند وجود ترکیبات فنلی ۶ـ mgcl2 کلرید منیزیم نقش کوفاکتوری در فعالیت آنزیم tag دارد .ir" target="_blank"> از سیکل دوم چهار مولکول ۳- polymerization گسترش رشته DNA : در این مرحله DNA پلیمراز شروع به همانند سازی می کند .ir" target="_blank"> تا گزارش پست ]

منبع
برچسب ها :

, , , , , , , , , , ,

آمار امروز جمعه 24 آذر 1396

  • تعداد وبلاگ :55489
  • تعداد مطالب :186104
  • بازدید امروز :145826
  • بازدید داخلی :12565
  • کاربران حاضر :185
  • رباتهای جستجوگر:108
  • همه حاضرین :293

دسته بندی موضوعات

تبلیغات

آخرین کلمات جستجو شده

تگ های برتر امروز

تگ های برتر