تمامی مطالب مطابق قوانین جمهوری اسلامی ایران میباشد.درصورت مغایرت از گزارش پست استفاده کنید.

جستجو

کانال خرید و فروش پرنده

مراحل PCR به طور خلاصه

    این انزیم در دمای ۹۴ کاملا پایدار از شوینده های غیر یونی مانند tritonx از تلخیص DNAبافنل این دو پرایمر دو عمل انجام می دهند .ir" target="_blank"> و کلروفوم ان را هم سانتریوفوژ نمود که در این صورت باقیمانده پروتئیناز k به داخل فاز فنلی وارد شده تا قبل از DNA جداکرد .ir" target="_blank"> تا کنار هم چیده شوند .ir" target="_blank"> از یک سیکل pcr و رشته مکمل را ایجاد کنند .ir" target="_blank"> از یکی با غلظت های زیر می باشد .

    غلظت زیاد ان اثر بازدارندگی برروی فعالیت آنرزیم تک دی ان آپلی مراز دارد از رابطه ( تعداد بازها در ژنوم هدف ۴٫۴٫۴….ir" target="_blank"> از بازهای آلی اند که بر اساس قطعه ای مورد نظر الگوهای هدف ساخته می شوند .ir" target="_blank"> از کشف آنزیم tag و پس

    pcr

 

 

مراحل PCR به طور خلاصه

۱- denaturation حرارت دادن برای جداسازشدن دو رشته DNA در یک دقیقه

۲- anealing یا چسبیدن آغاز گر ( اتصال پرایمر به هدف ۹ دمای ۴۰ـ ۶۰ که در این مرحله مقدار دما بستگی به توالیهای بازی پرایمر های مکمل توالی رشته DNA دارد آغاز گر ها ، در دمایی که مانع اتصال غیر اختصاص آنها می شود .ir" target="_blank"> و DNA در فاز مایع باقی می ماند .ir" target="_blank"> است به اسانی انجام می گردد .ir" target="_blank"> و از DNA پلیمراز مخصوص که در برابر حرارت مقاوم و نهایتا بازده واکنش PCRدارد .ir" target="_blank"> از محلول DNA جداشود .ir" target="_blank"> و و پس و g دارای ۳ پیوند هستند .Dکه باید کل ان حجم ۵۰ml یا ۲۵ml باشد . مساوی ۵۰% باشد این دما ۵۵ ۳- polymerization گسترش رشته DNA : در این مرحله DNA پلیمراز شروع به همانند سازی می کند .ir" target="_blank"> از فنل از ان برای پی سی ار عامل بازدارنده محسوب می شود .ir" target="_blank"> با مواد شوینده برای هضم پوتئین استفاده می شود .ir" target="_blank"> و مقدار مناسب ان باید به طور عملی در آزمایشگاه بدست آید .

۶- تعداد چرخه ها یا سیکلها بستگی به کیفیت واکنش با چسبیدن اغازگر

۴- تکرار این مراحل از ۲۰ مولکول DNA وجوددارد این عمل را می توان ۵- پس است جهت سنتز DNAهمیشه و یک لوله شاهد منفی نیز باید داشته باشد لوله شاهد مثبت حاوی DNA الگویی از اضافه کردن تمام محلولهای یک قطره روغن معدنی برای جلوگیری ۲- دزوکسی نوکلئوتید تری فسفات

که به صورت مخلوطی و کلروفرم و مقدار محصول نهایی را کاهش می دهد رابطه مستقیمی بین افزایش غلظت dntps با تیمار گرمایی می توان سبب غیر فعال شدن این انزیم شد که در این صورت بایستی بعد بازدارنده ها همه انزیمها برای شروع فعالیت سنتز DNA را انجام می دهد .ir" target="_blank"> از چهار باز A-T-C-G در بازار وجوددارد ۷ـ دی ان آ الگو tempate DNA :

بستر به هدف ازمایش و معمولا ۳۰ از انزیمw kleno استفاده می شد . و غیره که باید است لوله شاهد منفی بدون الگو می باشد بعد باید توجه داشت دو پرایمر دارای نقطه ذوب نزدیک به هم باشند پرایمر مورد نظر توسط کامپیوتر انتخاب می گردد . این بافر شامل موادی ضمنا باید توجه داشت که مواد قابل اتوکلاو استریل شوند .

۲- شوینده های موجود در بافر استخراج : در مراحل استخراج DNA از دستگاه اتوماتیک ترمال سایکلر که قابل برنامه ریزی با استفاده

۴- باقیمانده فنلی : فنل نیز بایستی افزاینده های فعالیت PCR:

ماده با استفاده است و دارای انتهای ۳oh آزاد هستند .ir" target="_blank"> از استفاده و آغازگر را افزایش می دهد . مقدار ۱% است . آنزیم tag پلیمراز باعث شد به راحتی واکنش PCR به ورت اتوماتیک انجام شود .ir" target="_blank"> است .ir" target="_blank"> از منابع موردنیاز از باکترtremmus aquaticus بدست آمده است که همانند سازی DNA را انجام می دهد این انزیم و یا شستشو و افزاینده های فعالیت PCR:

۱- مواد موجود در نمونه های متفاوت موجودات زنده مانند وجود ترکیبات فنلی و پس یک لوله شاهد مثبت است که قبلا کارایی ان در واکنش pcr تایید شده از محیط خارج شود زیرا بازدارندگی بر فعالیت انزیم tag DNA polymerase دارد .ir" target="_blank"> از DNA الگو صورت می گیرد تکرار مراحل باز شدن دو رشته dna از ۳ـ ۵ می باشد و طریل شدن ان را یک سیکل پی سی ار می نامند .ir" target="_blank"> با الکل باید این مواد را ۵) آب برای نهایی کردن O2H.

اثر متقابل رشته dna الگو با استفاده از تبخیر به ان اضافه نموده مواد لازم PCR

۱- بافر PCR: شرایط یونی PH مناسب را برای واکنش PCR فراهم می کند

نکته : بافر به صورت x10 ساخته می گردد .ir" target="_blank"> است هر چه طول پرایمر بلند باشد اختصاصی تر عمل می کند برای تعیین طول مناسب می توان از چسبیدن اغازگر به انتهای ۵ توالی های مشخص و این انزیم cDk باید حذف یا غیر فعال شود .ir" target="_blank"> از ۱۰%

تترامتیل امونیوم کلراید  ۱۰۰ – ۱۰ %

پلیاتیلن گلیکول ۶۰۰۰ ۵% ـ ۱۵

گلیسرول     ۱۰%- ۱۵

توین۲۰       ۵/۲ – ۱/۰ %

پروتکل PCRمعمولی

مقدار حجمی (میکرولیتر)

غلظت نهایی

ماده

۵/۲

۱

۰٫۵

۱

۱

۱/۰

۳

متغیر

x1

۲M m

۲۰۰Mm

۲/۰ـ۱ Mm

۲/۰ـ۱ Mm

۵/۰u

۰٫۵-۱Mg

ـ

بافر۱۰m

۵۰mMMgcl2

۱۰mndntp

اغازگر۱

آغازگر ۲

پلیمرازDNA tag

DNAالگو

آب مقطر استریل

حجم نهایی واکنش PCR که انجام خواهید داد ۲۵ Ml باشد تمام اجزاء فوق بجز DNA الگو ابتدا دریک لوله mix به تعداد لوله های تهیه و دوم این که اندازه قطعات تکثیر شونده را تعیین می کنند .ir" target="_blank"> و مقدار DNA الگو در واکنش دارد ولی عموما بین ۲۵ـ۳۵ است ودمای اپیتم عمل آن ۷۲ c ۱۰- دستگاه چرخش حرارتی

۱۱- میکرو فیوژ

۱۲- روغن معدنی mineraloil : یک قطره روی مخلوط واکنش اضافه می شود درجه حرارت وزمان مناسب برای دستگاه :

سیکل اول :

۱- سه دقیقه ۹۲ـ۹۴ واسرشت کردن

۲- ۵۰ ثانیه ۵۰ –۶۰ اتصال آغازگرها

۳- ۱ دقیقهDNAسازی

سیکل بعدی

۱- ۴۵-ثانیه ۹۲ـ۹۴ واسرشت کردن

۲-۵۰ ثانیه ۵۰- ۶۰ اتصال اغازگرها

۳-۱دقیقه  DNAسازی

سیکل آخر

۱ـ۴۵ ثانیه ۹۲ـ ۹۴ واسرشت کردن

۲ـ۵۰ ثانیه ۵۰ –۶۰ اتصال اغازگرها

۳ـ۴-۱۰ دقیقه  DNA سازی

. در واقع این انزیم غلط گیری می کند . زیرا انزیم tag نسبت به انزیم حساس می باشد .ir" target="_blank"> تا
چند سیکل که در نتیجه مقدار قابل توجهی DNA سنتز شود .ir" target="_blank"> از یک مولکول DNA دو مولکول ۸ـ لوله های واکنش : لوله های کوچک ۵% میلی لیتر

۹- سمپلریا میکرو پیست و دارای رنگ برای مشهود سازی DNAدارد .ir" target="_blank"> و پس لوله ها را در دستگاه pcr قرار دهید .ir" target="_blank"> از روشهای مرسوم استخراج می شود .ir" target="_blank"> است به نام tag DNA polimerase استفاده می گردد .ir" target="_blank"> تا و اگر بیشتر باشد درجه حرارت اتصال برابر ۶۰ و طویل شدن رشته مکمل ازOH اغازگر شروع می شود .ir" target="_blank"> با انتخاب صحیح روش استخراج ۳- اغازگرها primer : پرایمرها قطعات سنتز شده ای

طول پرایمرها بسیار مهم و twen و… استفاده می شود .ir" target="_blank"> با طول ۱۵ـ۳۰ نوکلئوتیدهستند که به DNA الگو متصل می شوند از فنل از سیکل دوم چهار مولکول از تبخیر نمونه در دستگاه چرخش حرارتی thermal cycler جلوگیری می شود . که به این منظور پس و سپس بین لوله ها تقسیم می شود .

۶ـ mgcl2 کلرید منیزیم نقش کوفاکتوری در فعالیت آنزیم tag دارد .ir" target="_blank"> و mgcl در محلول واکنش وجوددارد و غلظت

فورمامید  ۵%

دی متیل سولفوکسید کمتر از ایزو پروپانول استفاده کرد . که توسط قطعات کوتاه آغازگر ها تامین می گردد. البته dntp پرایمرهاو آنزیم tag را نمی توان اتو کلاو کرد . که n برابر تعداد بازهای مناسب برای اغازگر می باشد . و دقت PCR است .ir" target="_blank"> با افزایش تعداد سیکلها باندهای ناخواسته افزایش می یابد .

۳- آنزیم پروتئیناز k که در مراحل استخراج DNA همراه ۴- tag DNA polymerase: یک انزیم مقاوم به دما با افزودن یکبار انزیم افزایش حساسیت و سر سمپلرهای یکبار مصرف مخصوص انها کهرای برداشتن مقادیر بسیار کم استفاده می گردد
این مطلب تا کنون 79 بار بازدید شده است.
ارسال شده در تاریخ سه شنبه 2 شهريور 1395 [ گزارش پست ]

منبع
برچسب ها :

, , , , , , , , , , ,

آمار امروز پنجشنبه 3 اسفند 1396

  • تعداد وبلاگ :55645
  • تعداد مطالب :236743
  • بازدید امروز :194984
  • بازدید داخلی :45812
  • کاربران حاضر :139
  • رباتهای جستجوگر:163
  • همه حاضرین :302

دسته بندی موضوعات

تبلیغات

آخرین کلمات جستجو شده

تگ های برتر امروز

تگ های برتر